多肽阵列芯片的原理类似于酶联免疫吸附测定（ELISA）。将成千上万的多肽通过化学交联、物理吸附等方法固定在玻璃、硅等材质的基片表面。然后将芯片与各种生物样品，如纯化的酶、抗体、患者或动物血清、细胞裂解液等进行孵育，样品中的目标分子会与芯片上的多肽发生特异性结合。结合后的复合物通过标记依赖的方式进行检测，如利用带有荧光标记的二抗与结合在多肽上的目标分子结合，再通过荧光扫描仪检测荧光信号，从而实现对蛋白质 - 多肽或蛋白质 - 蛋白质相互作用的研究。