重组抗体表达
重组抗体表达是利用基因工程技术将编码抗体的外源基因导入宿主细胞，通过细胞培养实现抗体的体外合成、分泌与纯化的技术，核心是脱离动物免疫体系，精准制备具有特定结合活性的抗体（如单克隆抗体、双特异性抗体、抗体片段等），是生物制药、科研试剂研发的核心技术之一，相比传统杂交瘤技术，具有表达量高、可工程化改造、无动物源性污染、适合大规模生产等优势。
一、重组抗体简介
重组抗体表达依托基因工程技术，将抗体外源基因导入宿主细胞实现体外合成与纯化，核心表达系统分为原核表达系统、真核表达系统，及特殊场景用的无细胞表达系统。不同系统在翻译后修饰、表达量、操作难度上差异显著，需根据抗体类型（完整抗体 / 片段）、应用场景（科研 / 临床） 针对性选择。
二、重组抗体表达的核心流程
通用流程为基因构建→载体转化 / 转染→宿主细胞培养→抗体纯化→活性鉴定，不同表达系统细节略有差异，以下为哺乳动物细胞（CHO/HEK293）表达完整 IgG的标准流程（最具行业代表性）：
1. 抗体基因的克隆与优化
- 基因获取：从杂交瘤细胞、免疫脾细胞或噬菌体展示文库扩增抗体重链（VH-CH）、轻链（VL-CL）编码基因；人工合成优化后的基因为当前主流方式。
- 密码子优化：根据宿主细胞密码子偏好性（如 CHO 细胞高频密码子）优化基因，提升翻译效率；添加信号肽序列（Igκ、VH 信号肽），引导抗体分泌至细胞外。
- 融合构建：将优化后的重链、轻链基因插入真核双表达载体，载体需包含启动子（CMV、EF1α）、筛选标记（潮霉素、嘌呤霉素）、polyA 尾、复制原点等核心元件。
2. 表达载体的转染与稳定细胞株构建
- 瞬时转染：通过脂质体、PEI、电转将重组载体导入 HEK293F 等宿主细胞，无需筛选，3~7 天短暂表达抗体，适用于科研快速小量制备，表达量 0.1~1g/L。
- 稳定转染：转染后通过筛选标记药物加压筛选 2~4 周，筛选出整合抗体基因的单克隆细胞株，经有限稀释法 / 流式分选获得高表达稳定株，适用于工业大规模生产，驯化后悬浮培养表达量可达 1~10g/L。
3. 宿主细胞的培养与抗体表达
核心为提供适宜营养与环境促进抗体分泌，按培养规模分为两类：
- 小规模培养：摇瓶悬浮培养，采用无血清、无蛋白的化学限定培养基，控制温度 37℃、CO₂浓度 5%、转速 120~150rpm，培养 5~7 天后收获细胞上清（抗体分泌于上清中）。
- 大规模培养：50L~20000L 生物反应器（搅拌式、波浪式）培养，自动控制 pH、溶氧、温度、补料速度，实现细胞高密度培养（活细胞密度 1×10⁷~5×10⁷cells/mL），大幅提升抗体总产量。
4. 重组抗体的分离与纯化
核心目标为去除杂蛋白、核酸、宿主细胞残留（HCP）、内毒素，获得纯度＞95% 的抗体，标准流程：
- 上清预处理：离心去除细胞碎片→0.22μm 滤膜过滤，澄清上清；
- 亲和层析（核心步骤）：采用 Protein A/G/L 层析柱，利用与抗体 Fc 段的特异性结合，一步富集粗纯抗体，回收率＞90%；
- 精细纯化：根据需求选择离子交换层析（阳离子 / 阴离子）、疏水相互作用层析、分子筛层析，去除聚集体、杂蛋白、残留 Protein A；
- 脱盐与除菌：脱盐柱置换缓冲液（如 PBS）→0.22μm 滤膜除菌，获得纯品抗体。
5. 重组抗体的活性与纯度鉴定
多维度检测验证抗体质量，核心检测指标：
- 纯度检测：SDS-PAGE（还原 / 非还原）、高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE），检测纯度是否＞95%，是否存在聚集体 / 片段；
- 活性检测：ELISA、SPR（表面等离子体共振）、流式细胞术，检测抗体与抗原的结合亲和力（KD 值）、特异性；
- 其他指标：内毒素检测（鲎试剂法）、宿主细胞残留（HCP ELISA）、核酸残留（qPCR）、糖基化分析（质谱）、效价检测（临床药物需更全面质控）。
三、重组抗体表达的关键优化策略
针对表达量低、抗体无活性、形成聚集体等常见问题，从全流程各环节优化，核心策略：
- 基因层面：密码子优化 + 高效信号肽筛选（如 Igκ 信号肽）+ 去除稀有密码子与基因二级结构；
- 载体层面：选用强启动子（EF1α 更适合长期稳定表达，优于 CMV）+ 双表达载体（保证重链、轻链摩尔比 1:1）；
- 细胞层面：筛选高表达单克隆株 + 细胞驯化（适应无血清悬浮培养、低温培养）；
- 培养层面：优化培养基配方（添加谷氨酰胺、生长因子）+ 流加补料策略 + 低温培养（30~32℃，减少聚集体，提升抗体活性）；
- 纯化层面：优化层析条件（pH、盐浓度）+ 增加分子筛步骤去除聚集体。
四、常见重组抗体形式及表达要点
重组技术可制备多种工程化抗体形式，适配不同应用场景，各形式表达要点各有侧重：
- 抗体片段（scFv、Fab、VHH）：优先选择大肠杆菌原核表达；需可溶性表达时，将基因与 GST、MBP 融合避免包涵体；VHH（纳米抗体）无轻链，原核表达效率极高，为科研、诊断试剂常用形式；
- 双特异性抗体（BsAb）：如 BiTE、IgG-scFv 型，优先选择 CHO/HEK293 哺乳动物细胞表达；通过 Knob-in-Hole 等 Fc 段基因工程改造技术，保证重链、轻链正确组装，减少错配；
- 抗体融合蛋白：如抗体 - 酶、抗体 - 细胞因子融合蛋白，选择昆虫细胞或哺乳动物细胞表达，保证融合蛋白双功能活性；
- 人源化抗体：将鼠源抗体 CDR 区移植到人源抗体框架区，通过哺乳动物细胞表达，降低免疫原性，为治疗性抗体主流形式。
五、技术应用领域
重组抗体表达技术是生物制药、生物科研的核心技术，应用覆盖多领域：
- 治疗性抗体药物：用于肿瘤（PD-1/PD-L1 抗体）、自身免疫病（TNF-α 抗体）、感染性疾病的靶向治疗；全球获批超 100 种抗体药物，均基于哺乳动物细胞重组表达；
- 科研与诊断试剂：作为 ELISA、WB、流式细胞术、免疫组化的一抗 / 二抗，及新冠、HPV 等病原体检测抗体；多为大肠杆菌 / 酵母表达的抗体片段或完整抗体；
- 抗体药物偶联物（ADC）：将重组抗体与毒素化学偶联，依托抗体靶向性将毒素递送至肿瘤细胞；抗体部分通过 CHO 细胞高纯度表达；
- 细胞治疗：如 CAR-T 细胞的靶向抗原结合域（scFv），经原核表达制备后用于 CAR 基因构建。
